Identificación molecular por PCR y nested PCR de rickettsias en Crassostrea gigas.

Abstract

La presente investigación se realizó del 5 de diciembre del 2011 al 20 de marzo del 2012 en el Laboratorio de Biología Molecular de la Facultad de Ingeniería Pesquera de la Universidad Nacional de Tumbes. Se pretendió determinar si los primers diseñados para PCR: CXcFw1 (CGGAAGGCAGCAGTAGGG) /CXcRev3 (CCGGGACTTTTTCTGTGGG) y nested-PCR: CxcFw1 (CGGAAGGCAGCAGTAGGG)/CXcRev4 (TATCTAAT CCTGTTTGCTCCCC) y CXcFw1/CXcRev2 (CGGAAGGCAGCAGTAGGG/ ACTTACTAAACCACCTACACACCC) permitirían detectar un fragmento del gen 16S ARNr en rickettsias en Crassostrea gigas. Para ello se realizó la extracción de ADN de muestras de branquias y masa visceral de C. gigas siguiendo el protocolo CTAB y para verificar la extracción adecuada se realizó una amplificación del gen de referencia de actina mediante PCR utilizando los primers Bi-actin-Fw y Bi-actin-Rev. Los resultados indican que la extracción de ADN fue adecuada pues se logró amplificar el gen de la actina, sin embargo los primers ensayados tanto para PCR como nested-PCR no permitieron detectar rickettsias en C. gigas, pero si permitieron amplificar el fragmento del gen 16S ARNr de una muestra de Ostrea iridescens correspondiente a una bacteria, que según la búsqueda realizada en GenBank, correspondió a una bacteria no cultivable (similitud de 94 %) y no emparentada con ninguna de las rickettsias cuyas secuencias están depositadas en dicha base de datos (similitud de 84 %). Se concluye que los primers ensayados tanto para PCR como nested-PCR no pudieron detectar rickettsias en las muestras analizadas, ya sea porque procedieron de C. gigas no infectadas o porque los primers no tuvieron la suficiente especificidad para detectarlas. Se recomienda realizar ensayos de detección de rickettsias utilizando primers diseñados para detectar otros genes tales como los genes que codifican las proteínas rOmpA y rOmpB, el gen gltA que codifica la citrato sintasa y el gen D.